重组腺相关病毒转导NIH3T3建立神经生长因子真核表达细胞株的研究

Establishment of mammal cellular strain expressing NGFβ by rAAV transfection of NIH3T3 cells

中文关键词:  重组腺相关病毒(rAAV),人神经生长因子(hNGF),NIH3T3细胞株,真核表达,生物活性

英文关键词:Recombinant adeno-associated virus(rAAV),Human nerve growth factor(hNGF),Eukaryotic expression,NIH3T3 cells,Bioactivity

中文摘要:

  目的探讨重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)转导美国国家健康研究中心建系的小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast,NIH3T3)建立神经生长因子β(nervegrowthfactorsubunitβ,NGFβ)真核表达细胞株可行性,并检测其生物活性。方法使用表达NGFβ的重组腺相关病毒感染NIH3T3细胞,取感染重组病毒的3T3细胞培养基上清,经表达蛋白提取和浓缩,肝素-SepharoseCL-6B亲和层析柱的纯化;酶免疫斑点法检测表达蛋白的NGFβ抗原活性;Coomassic亮蓝G250法测定表达蛋白的浓度;十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfat-polyarylanidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析检测表达蛋白的分子量,计算表达蛋白占总蛋白的比率;鸡胚背根神经节突起生长实验和小鼠嗜铬瘤细胞(mousea鄄drenalpheochromocytomacells,PC12)无血清培养生长刺激5溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyurididne,Brdu)掺入实验观察真核表达蛋白的生物学活性。结果转导的3T3细胞具有13.6kd的表达蛋白,每升细胞培养基中可以获得400~500μgNGFβ蛋白,表达蛋白纯度可达95.4%以上。表达蛋白具有很强的NGF抗原活性。鸡胚背根神经节突起生长实验显示真核表达的NGFβ在10ng/ml时有明显的促进突起生长作用,PC12细胞的Brdu掺入实验显

英文摘要: